Proteiinin puhdistusmenetelmät

Tärkeä osa bioteknologian tutkimusta on käyttää proteiinitekniikoita proteiinien suunnitteluun tai muokkaamiseen optimoiduilla ominaisuuksilla tiettyihin teollisiin sovelluksiin. Tämän tutkijan on kyettävä eristämään ja puhdistamaan kiinnostavia proteiineja, jotta niiden konformaatiot, substraattispesifiset ominaisuudet, reaktiot muiden ligandien kanssa ja spesifiset aktiivisuudet voidaan tutkia.

Vaadittu proteiinipuhdistuma riippuu proteiinin käyttötarkoituksesta.

Joissakin sovelluksissa riittämätön raakatuote. Muissa käyttötavoissa, kuten elintarvikkeissa ja lääkkeissä, tarvitaan kuitenkin korkeaa puhtausastetta. Tämän saavuttamiseksi käytetään useampaa proteiinin puhdistusmenetelmää useiden puhdistusvaiheiden sarjassa.

Jokainen proteiinin puhdistusvaihe johtaa yleensä jonkin verran tuotteen menetykseen. Siksi ihanteellinen proteiinin puhdistusstrategia on sellainen, jossa puhdistuksen korkein taso saavutetaan pienimmissä vaiheissa. Käytettävien vaiheiden valinta riippuu kohdeproteiinin koosta, varauksesta, liukoisuudesta ja muista ominaisuuksista. Seuraavat tekniikat sopivat parhaiten yhden sytosoliproteiinin puhdistamiseksi. Sytosoliproteiinikompleksien puhdistaminen on monimutkaisempaa ja tavallisesti vaatii erilaisten menetelmien soveltamista.

Ensimmäiset vaiheet proteiinin puhdistamiseksi

Ensimmäisen vaiheen solunsisäisen (solun sisällä) proteiinien puhdistamiseksi on raakatuotteen valmistaminen.

Uute sisältää monimutkaisen seoksen kaikista proteiinista solusytoplasmasta ja eräistä lisä makromolekyyleistä, kofaktoreista ja ravintoaineista. Raaka uutetta voidaan käyttää joihinkin bioteknologian sovelluksiin, mutta jos puhtaus on ongelma, on noudatettava seuraavia puhdistusvaiheita. Raa'at proteiiniuutteet valmistetaan poistamalla solujen hajotuksesta syntyvä solukerros, joka saadaan kemikaaleilla ja entsyymeillä, sonikaatiolla tai ranskalaisella puristimella.

Jäte poistetaan sentrifugoimalla ja supernatantti otetaan talteen. Ekstrasellulaaristen proteiinien raakavalmisteet voidaan saada yksinkertaisesti poistamalla solut sentrifugoimalla.

Tietyissä biotekniikkasovelluksissa tarvitaan termostabiili entsyymiä : Entsyymit, jotka kestävät korkeita lämpötiloja ilman denaturointia ja samalla säilyttävät suuren spesifisen aktiivisuuden. Organismeja, jotka tuottavat niitä kutsutaan toisinaan extremofiileiksi. Helppo lähestymistapa lämmönkestävän proteiinin puhdistamiseksi on denaturoida seoksen muut proteiinit kuumentamalla ja jäähdyttämällä liuos (jolloin termostabiili entsyymi voidaan tarvittaessa uudistaa tai liuottaa uudelleen). Denaturoidut proteiinit voidaan sitten poistaa sentrifugoimalla.

Väliaikaiset puhdistusvaiheet

Aiemmin yhteinen toinen vaihe proteiinin puhdistamiseksi raakatuotteesta oli saostus liuoksella, jolla oli suuri osmoottinen lujuus (ts.e. suolaliuokset). Raakatuotteessa olevat nukleiinihapot voidaan poistaa saostamalla streptomysiinisulfaatilla tai protamiinisulfaatilla muodostuneet aggregaatit. Proteiinisaostus tehdään tavallisesti ammoniumsulfaatilla suolana.

Erilaiset proteiinit saostuvat eri pitoisuuksina ammoniumsulfaattia .

Yleensä korkeamman molekyylipainon omaavat proteiinit saostuvat ammoniumsulfaatin pienemmissä pitoisuuksissa. Suolan saostaminen ei yleensä johda erittäin puhdistettuun proteiiniin vaan voi auttaa poistamaan joitain ei-toivottuja proteiineja seoksessa ja konsentroimalla näyte. Sitten liuoksessa olevat suolat poistetaan dialyysillä huokoisen selluloosajohtimen läpi, suodattamalla tai geeli-poissulkeva kromatografia.

Nykyaikaiset biotekniikkaprotokollat ​​hyödyntävät usein monia kaupallisesti saatavilla olevia sarjoja, jotka tarjoavat valmiita ratkaisuja vakiotoimenpiteisiin. Proteiinin puhdistus suoritetaan usein käyttämällä suodattimia ja valmistettuja geelisuodatuspylväitä. Sinun tarvitsee vain noudattaa ohjeita ja lisätä oikean määrän oikeaa liuosta ja odottaa tietyn ajan, kun kerätään eluenttia (mikä tulee kolonnin toiseen päähän) tuoreessa koeputkessa.

• Kromatografisia menetelmiä voidaan soveltaa käyttämällä penkki-pylväitä tai automatisoituja HPLC-laitteita. HPLC: llä tapahtuva erottaminen voidaan tehdä käänteisfaasi-, ioninvaihtokehys- tai koon poissulkemismenetelmillä ja näytteillä, jotka on havaittu diodiryhmällä tai lasertekniikalla.

  Proteiinin visualisointi ja puhdistuksen arviointi

  • Reverse phase-kromatografia (RPC) erottaa proteiinit niiden suhteellisen hydrofobisuuden perusteella. Tämä tekniikka on erittäin valikoiva, mutta vaatii orgaanisten liuottimien käyttöä. Jotkin proteiinit denaturoidaan pysyvästi liuottimilla ja menettävät toiminnallisuuden RPC: n aikana. Siksi tätä menetelmää ei suositella kaikille sovelluksille, varsinkin jos se on tarpeen kohdeproteiinin säilyttämiseksi.
  • Ion-exchange-kromatografia viittaa proteiinien erottamiseen latauksen perusteella. Pylväät voidaan joko valmistaa anioninvaihdolle tai kationinvaihdolle. Anioninvaihto sarakkeet sisältävät kiinteän vaiheen, jossa on positiivinen varaus, joka houkuttelee negatiivisesti varautuneita proteiineja. Kationinvaihto sarakkeet ovat käänteisiä, negatiivisesti varautuneita helmiä, jotka houkuttelevat positiivisesti varautuneita proteiineja. Kohdeproteiinin eluoituminen tapahtuu muuttamalla pH-arvoa kolonnissa, mikä johtaa kunkin proteiinin varautuneiden funktionaalisten ryhmien muuttamiseen tai neutralointiin.
  • Kokoekskluusiokromatografia ( geelisuodatus ) erottaa suuremmat proteiinit pieniltä, ​​koska suuremmat molekyylit kulkevat nopeammin ristisilloitetun polymeerin läpi kromatografiakolonnissa. Suuret proteiinit eivät sovi polymeerin huokosiin, kun taas pienemmät proteiinit tekevät ja kestää kauemmin kromatografiapylvään kautta niiden vähemmän suoraa reittiä. Eluaatti kerätään sarja putkia, jotka erottavat proteiinit eluoitumisaikaan perustuen. Geelisuodatus on hyödyllinen työkalu proteiininäytteen konsentroimiseksi, koska kohdeproteiini kerätään pienemmässä eluointimäärässä kuin alun perin lisättiin kolonniin.Samankaltaisia ​​suodatustekniikoita voidaan käyttää laajamittaisen proteiinituotannon kustannustehokkuuden vuoksi.
  • Affiniteettikromatografia on erittäin käyttökelpoinen tekniikka "kiillottamiseen" tai proteiinin puhdistusprosessin loppuunsaattamiseksi. Kromatografiapylväässä olevat helmet ristisoituvat ligandeihin, jotka sitoutuvat spesifisesti kohdeproteiiniin. Proteiini poistetaan sitten kolonnista huuhtelemalla liuoksella, joka sisältää vapaita ligandeja. Tämä menetelmä antaa puhtaimmat tulokset ja korkeimman spesifisen aktiivisuuden verrattuna muihin tekniikoihin.
• SDS-PAGE on polyakryyliamidigeelielektroforeesi, joka suoritetaan SDS: n (natriumdodekyylisulfaatti) läsnä ollessa, joka sitoutuu proteiineihin, mikä antaa heille suuren negatiivisen maksun. Koska kaikki proteiinit ovat melko tasaisia, tämä menetelmä erottaa ne melkein kokonaan koon perusteella. SDS-PAGE: ta käytetään usein proteiinin puhtauden testaamiseen sarjan jokaisen vaiheen jälkeen. Kun ei-toivottuja proteiineja vähennetään vähitellen seoksesta, SDS-PAGE-geelillä visualisoituja vyöhykkeitä vähennetään, kunnes vain yksi kaista edustaa haluttua proteiinia.
• Immunoblottaus on proteiinin visualisointitekniikka, jota käytetään yhdessä affiniteettikromatografian kanssa. Spesifisen proteiinin vasta-aineita käytetään ligandeina affiniteettikromatografiapylväässä. Kohde-proteiini pidetään pylväässä, minkä jälkeen se poistetaan huuhtelemalla kolonni suolaliuoksella tai muilla aineilla. Radioaktiivisiin tai väriaineisiin liittyviin vastaaviin tarkoitetut vasta-aineet auttavat kohdeproteiinin havaitsemisessa, kun se erotetaan muusta osasta.

Lähteet:

Zubay G. 1988. Biochemistry, 2. painos. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. // www. Biochem. uiowa. edu / Donelson / Tietokanta% 20items / protein_purification_handbook. PDF.