DNA-amplifikaatio polymeraasiketjureaktiolla

PCR tarkoittaa polymeraasiketjureaktiota, molekyylibiologista tekniikkaa DNA-segmenttien amplifioimiseksi tuottamalla useita kopioita käyttäen DNA-polymeraasientsyymejä kontrolloiduissa olosuhteissa. Niinkin pieni kuin yksi DNA-segmentin tai geenin kopio voidaan kloonata miljooniksi kopioiksi, mikä mahdollistaa väriaineiden ja muiden visualisointitekniikoiden tunnistamisen.

Vuonna 1983 kehitetty PCR-prosessi on mahdollistanut DNA-sekventoinnin suorittamisen ja tunnistaa nukleotidien järjestyksen yksittäisissä geeneissä.

Menetelmä käyttää lämpösykliä tai reaktiota toistuvasti kuumentamalla ja jäähdyttämällä DNA: n sulamista ja replikaatiota varten. Koska PCR jatkuu, "uutta" DNAa käytetään templaattina replikaatiota varten ja ketjureaktio seuraa eksponentiaalisesti DNA-templaatin vahvistamista.

PCR-tekniikoita sovelletaan monilla bioteknologian aloilla, mukaan lukien proteiinitekniikka, kloonaus, rikostekniset (DNA-sormenjäljet), isyyskoe, perinnöllisten ja / tai tartuntatautien diagnoosi sekä ympäristönäytteiden analysointi.

Erityisesti rikostekniikassa PCR on erityisen hyödyllinen, koska se vahvistaa jopa pienimpiä DNA-todisteita. PCR: ää voidaan käyttää myös tuhansia vuosia vanhempia DNA: n analysointiin, ja näitä tekniikoita on käytetty identifioimaan kaikki 800 000-vuotisesta mammutista mummiin ympäri maailmaa.

PCR-prosessi on seuraava:

• Alustus: Tämä vaihe on välttämätön vain DNA-polymeraaseille, jotka vaativat kuumapäinen PCR. Reaktiota kuumennetaan 94 - 96 ° C: seen ja pidetään 1-9 minuutin ajan.

• Denaturointi: Jos menetelmä ei vaadi alustusta, denaturointi on ensimmäinen askel. Reaktiota kuumennetaan 94-98 ° C: seen 20-30 sekunnin ajan. DNA-templaatin vetysidokset hajoavat ja muodostetaan yksijuosteiset DNA-molekyylit.
• Hehkutus: Reaktiolämpötila on pienempi välillä 50 - 65 ° C ja pidetään 20-40 sekuntia. Alukkeet kiinnittyvät yksijuosteiseen DNA-templaattiin. Lämpötila on äärimmäisen tärkeä tässä vaiheessa. Jos se on liian kuuma, aluke ei ehkä sitoudu. Jos se on liian kylmä, aluke voi sitoa epätäydellisesti. Hyvä sidos muodostuu, kun alukesekvenssi vastaa läheisesti mallisekvenssiä.
• Pidennys / venymä: Lämpötila tässä vaiheessa vaihtelee polymeraasityypin mukaan. DNA-polymeraasi syntetisoi täysin uuden DNA-juosteen.
• Lopullinen pidennys: Tämä vaihe suoritetaan 70-74 ° C: ssa 5-15 minuutin ajan lopullisen PCR-syklin jälkeen.
• Lopetus: Tämä vaihe on valinnainen. Lämpötila pidetään 4-15 ° C: ssa ja se peittää reaktion.

Menettely on jaettu kolmeen vaiheeseen:

• Eksponentiaalivahvistus: Jokaisen syklin aikana tuote (tietyn DNA-kappale, joka toistetaan) kaksinkertaistuu.
• Tasoitusaste: Koska DNA-polymeraasi menettää aktiivisuuttaan ja kuluttaa reagensseja, reaktio hidastuu.
• Plateau: Tuotetta ei kerty enää.