Tekniikat DNA sekvensointiin

Biotekniikan ala on jatkuva muutos. Uusimpien tutkimusten nopea kasvu ja kehittäminen riippuvat tutkijoiden innovaatiosta ja luovuudesta sekä heidän mahdollisuuksistaan ​​nähdä perusmetallitekniikan mahdollisuudet ja soveltaa sitä uusiin prosesseihin. PCR: n tuottaminen avasi monia ovia geneettisessä tutkimuksessa, mukaan lukien DNA-analyysin ja DNA-sekvenssien perusteella erilaisten geenien tunnistaminen.

DNA-sekvensointi riippuu myös kyvystämme käyttää geelielektroforeesia erillisten DNA-säikeiden erottamiseksi kooltaan niin vähän kuin yksi emäsparin.

DNA-sekvensointi

1970-luvun lopulla keksittiin kaksi DNA-sekvensointitekniikkaa pidemmille DNA-molekyyleille. Nämä olivat

Sanger (tai dideoksi) -menetelmä ja Maxam-Gilbert (kemiallinen pilkkoutumismenetelmä). Maxam-Gilbert -menetelmä perustuu nukleotidispesifiseen kemikaalien pilkkomiseen ja sitä käytetään parhaiten oligonukleotidien sekvensoimiseksi (lyhyet nukleotidipolymeerit, tavallisesti pienempiä kuin 50 emäsparia pitkä). Sanger-menetelmää käytetään yleisemmin, koska se on osoittautunut teknisesti helpommaksi soveltaa, ja PCR: n myötä ja tekniikan automatisoinnin avulla voidaan helposti soveltaa pitkät DNA-juosteet, mukaan lukien muutamat kokonaiset geenit. Tämä tekniikka perustuu ketjun päättämiseen dideoksynukleotideilla PCR-venymisreaktioiden aikana. Sanger-menetelmällä

Sanger-menetelmällä analysoitavaa DNA-juostea käytetään templaattina ja DNA-polymeraasia käytetään PCR-reaktiossa, jotta saadaan aikaan ilmaisia ​​säikeitä käyttäen alukkeita.

Valmistetaan neljä erilaista PCR-reaktioseosta, joista kukin sisältää tietyn prosenttiosuuden dideoksinukleosiditrifosfaatti (ddNTP) -analogeista yhteen neljästä nukleotidista (ATP, CTP, GTP tai TTP). Uuden DNA-juosteen synteesi jatkuu, kunnes yksi näistä analogeista sisällytetään, jolloin juoste on lyhennetty ennenaikaisesti.

-3 ->

Jokainen PCR-reaktio päättyy, joka sisältää eri pituisia DNA-juosteita, jotka kaikki päättyy nukleotidiin, joka oli dideoksilla leimattu kyseiseen reaktioon. Sitten geelielektroforeesia käytetään erottamaan neljän reaktion säikeet neljällä erillisellä kaistalla ja määrittämään alkuperäisen templaatin sekvenssi perustuen siihen, mitä pituuksia säikeistä päättyy mitä nukleotidiin.

Automaattisessa Sanger-reaktiossa käytetään alukkeita, jotka on merkitty neljällä eri värillisellä fluoresoivalla tunnistimella. PCR-reaktioita, erilaisten dideoksi-nukleotidien läsnä ollessa, suoritetaan edellä kuvatulla tavalla. Seuraavaksi kuitenkin neljä reaktioseosta yhdistetään ja levitetään yhteen ainoaan geeliin. Kunkin fragmentin väri detektoidaan lasersäteen avulla, ja informaatio kerätään tietokoneella, joka tuottaa kromatogrammeja, jotka näyttävät huippuja jokaiselle värille, josta templaatti-DNA-sekvenssi voidaan määrittää.

Automaattinen sekvensointimenetelmä on tyypillisesti vain tarkka sekvensseille, joiden pituus on korkeintaan noin 700-800 emäsparia. On kuitenkin mahdollista saada suurempien geenien ja itse asiassa kokonaisten genomien täydet sekvenssit käyttämällä vaiheittaisia ​​menetelmiä, kuten Primer Walking ja Shotgun-sekvensointi.

In

Primer Walking

, suuremman geenin käsittelemätön osa sekvensoidaan Sanger-menetelmällä. Uusia alukkeita tuotetaan sekvenssin luotetta- vasta segmentistä ja käytetään jatkamaan sekvensoimalla geenin osaa, joka oli alkuperäisten reaktioiden ulkopuolella. Shotgun-sekvensointi edellyttää satunnaisesti leikattua mielenkiinnon kohteena olevaa DNA-segmenttiä sopivammiksi (hallittaviksi) kokoisiksi fragmentteiksi, sekvensoimalla kukin fragmentti ja järjestämällä kappaletta päällekkäisten sekvenssien perusteella. Tätä tekniikkaa on helpotettu soveltamalla tietokoneohjelmistoa päällekkäisten kappaleiden järjestämiseksi.